Anticuerpos

INDUCCIÓN DE ANTICUERPOS EN RATÓN CONTRA LA PROTEÍNA AKNA INYECTANDO DNA PLASMÍDICO.

Ana Alicia Román Gonzáleza
Ingeniero en Biotecnología
Universidad Politécnica del Estado de Morelos
trabajo realizado en
Centro de Investigación sobre enfermedades infecciosas
Instituto Nacional de Salud Publica.

En este trabajo la propuesta es obtener anticuerpos contra la proteína Akna, la cual recientemente se ha reportado que es un regulador transcripcional clave de moléculas inmuno moduladoras. El gen akna se localiza en el cromosoma 9 y de acuerdo a análisis de expresión de cDNA, codifica para potencialmente 9 isoformas de AKNA. En tejidos sanos humanos se ha detectado la expresión de Akna en los nódulos linfáticos, bazo y en menor cantidad en el timo, principalmente se expresa en linfocitos B y T, células asesinas naturales y células detríticas. Se han identificado dos dominios funcionales en Akna un dominio denominado PEST, involucrado en degradación rápida de proteínas por la vía del proteasoma. Por otro lado el motivo AT-hook de unión a ADN interactúa con el surco menor del ADN en regiones ricas de adenina y timina (A/T); este dominio es formado por 9 aminoácidos RTEGRPADS, en donde el tripéptido GRP (Glicina, Prolina y Arginina), es el centro de dominio de unión a ADN, y los cuales están 100% conservados. Existen evidencias de que AKNA se une directamente mediante el dominio AT-hook, a los elementos reguladores ricos en A/T del promotor del receptor CD40 (ctcttaataaatgcctgtct) y del ligando CD40 (agctaaattttatttaataattatgcc), regulando la coexpresión de ambos. Recientemente se estudia Akna como un posible candidato de terapia génica para mejorar la respuesta inmune antitumoral. La disponibilidad de anticuerpos específicos contra Akna ha limitado el estudio de la detección de las isoformas de Akna por lo que es relevante la obtención de anticuerpos específicos para conocer la importancia fisiológica y el perfil de expresión de Akna en múltiples tejidos y en distintos órganos. Para generar anticuerpos contra Akna se realizó la purificación de los plásmidos: pCDNA3, como control y pCDNA3Akna (14B) que contiene el gene akna clonado bajo un promotor que se expresa en eucariontes. Se prepararon células competentes E. coli mediante la técnica de CaCl con cultivos de la cepa DH5α, crecidos a una densidad óptica de 0.375. Se alicuotaron las bacterias colocando 250µl de la suspensión + 250µl de glicerol al 80%, y se almacenaron a -70°C. Las células competentes se transformaron mediante la técnica de heat shock, (con 10ng de DNA). La purificación del ADN plasmídico se realizó por el método de lisis alcalina y los plásmidos se trataron con PEG 8000 para eliminar endotoxinas y quedaran suficientemente limpios tanto para transfectar líneas celulares como para inyectar a ratones. Se obtuvieron los plásmidos limpios,a una concentración de pCDNA3 [8135 ng/μl ] y pCDNAAKNA [3285 ng/μl]. Dos grupos de 5 ratones cada uno, fueron inoculados tanto con pCDNA3como con pCDNAkna resuspendidos en PBS 1 X a una concentración final de 50 µg/100 µl. Se tomaron los sangrados de la cola de cada ratón un día antes de cada inmunización. Se realizaron un total de 4 inmunizaciones cada 15 días y 7 sangrados incluido el pre-inmune. Una vez recolectada la sangre se obtuvo el suero y se congelo a -20 C. Independientemente se transfectaron los plásmidos mencionados en la línea celular HeLa a un 70% de confluencia con una mezcla de 5g ADN plasmídico, con 10 µl de reactivo de Transfección (Lipofectamina). De las células transfectadas se purifico, por una parte RNA con reactivo Trizol y se detecto la expresión de akna mediante RT-PCR, y por otra parte se purificaron proteínas con las que en estos momentos se están realizando ensayos de Wstern blot utilizando los sueros de los ratones inyectados con plásmido para detectar la presencia de anticuerpos específicos anti-Akna en los sueros de ratones.


Área de Especialidad: Ingeniería en Biotecnología
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